巨噬细胞识别酿酒酵母孢子的研究（一） 酿酒酵母为了传宗接代

酿酒酵母是巨噬酵母公认的有益于人类的真菌，在营养条件充足的细胞情况下它进行有丝分裂，此时的识别酵母以营养态细胞状态存在。但是酿酒，在碳源或氮源等营养条件匮乏的研究情况下，酿酒酵母为了传宗接代，巨噬酵母会进行减数分裂，细胞产4个孢子包裹于子囊中。识别营养态酵母细胞壁有两层，酿酒分别是研究内层葡聚糖层和外层的甘露糖蛋白层。酵母孢子壁有4层，巨噬酵母从内到外依次是细胞甘露糖层、葡聚糖层、识别壳聚糖层和二酪氨酸层。酿酒二酪氨酸层是研究酵母孢子壁特有的结构，其单体是由两个甲基酪氨酸分子构成。这种特殊的孢子壁结构能帮助减数分裂后的细胞核抵御严酷的大自然环境，等待适宜的生长环境，从而发芽成长，再次成为营养细胞形态，维持酵母的繁衍。

巨噬细胞属于免疫细胞的一种，能够吞噬和降解外源颗粒以及微生物并激活免疫反应。巨噬细胞的吞噬过程依赖于细胞表面的模式识别受体，该受体能够识别微生物表面保守的分子模式并且激活受体上酪氨酸基序。被激活的ITAM序列进一步招募脾酪氨酸激酶启动巨噬细胞的吞噬过程。Svk信号能够激活诸如磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶等下游信号，从而增加吞噬效率。吞噬过程中，较大颗粒(＞2μm)吞噬依赖于P13K的活性。巨噬细胞对微生物表面分子模式的识别是启动直接吞噬的第一步。微生物表面的糖链结构的特殊性使其被巨噬细胞所识别从而引起吞噬。

自然条件下，多数酵母处于营养细胞态。营养态酵母壁的葡聚糖成分能够被巨噬细胞表面葡聚糖受体识别从而引起吞噬，促进巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的释放，葡聚糖也能够与细菌结合从而抑制细菌在胃肠道增殖从而达到抑菌的作用。营养态酵母壁的几丁质成分也能刺激巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6，并且增强巨噬细胞对假丝酵母的杀伤作用圈。营养态酵母壁上这些免疫活性物质的存在使得营养态酵母作为饲料添加物能够增强牛和猪的免疫力。
酿酒酵母虽为与人类共生的真菌，但目前其子囊孢子形态对免疫系统的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖层被壳聚糖层和二酪氨酸层严密包裹。其免疫活性物质未知。作者以小鼠RAW264.7细胞作为巨噬细胞模型，研究了巨噬细胞识别和吞噬酵母孢子的作用机制，为后续探究野生型酵母孢子免疫作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

作者使用高效产孢率的AⅣJ2D二倍体酿酒酵母菌株，以及ditl△和hs3△突变体菌株，均来自作者所在实验室保藏菌株，相关信息见表1。

1.2 细胞及培养

RAW264.7小鼠巨噬细胞，购自中科院菌种保藏库，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，条件为5％CO2，37℃。

1.3 培养基

YPAD培养基：蛋白胨A10g，酵母提取物5g，腺嘌呤15mg溶解于450mL去离子水中，灭菌后加入50mL质量浓度为20g/dL的葡萄糖混匀。固体培养基则加入琼脂(Agar)10g一起灭菌，之后加入葡萄糖混匀，倒平板。

YPAce培养基：蛋白胨A20g，酵母提取物10g，腺嘌呤30mg，醋酸钾10g溶解于lL去离子水中，高压湿热灭菌。
KAc培养基：称取20gKAc溶于1L去离子水中，固体培养基加入20g的琼脂粉，高压灭菌，倒平板。

1.4 主要试剂和仪器

主要试剂有：DMEM高糖培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，昆布糖(Sigma)，葡聚糖微球(Sigma)，PBS(生工)，胰蛋白酶(生工)，蛋白酶K(Sigma)，溶菌酶(Sigma)；主要仪器有：细胞培养箱(Thermo)，离心机(Takara)，显微镜(日立)等。

1.5 酵母培养

酵母菌株于固体YPAD平板划线培养3d后，用粗头牙签接种于5mLYPAD液体培养基，转接于100mL液体YPAD培养基培养3～5h，使酵母处于对数生长期并且0D₆₆₀为0.6～0.8，此时收集营养态酵母，用0.5％吐温-20洗3次后再用去离子水洗3次，3000r/min离心，称质量备用。酵母孢子的制备：营养态酵母过夜培养后，取10mL转接到200mL的YPAce培养基中，培养12h后离心转移到2％KAc培养基后续培养2d；离心收集子囊酵母，当产孢率大于95％时，离心收集菌体，PBS洗2次，加入5mL原生质体溶液(1.2mol/L山梨醇，0.1mol/LPBS)和50μL(10OOOU/mL)溶菌酶，于25℃摇床处理3h；原生质体溶液洗2次，去离子水洗2次，加入5mL去离子水超声20min(45％功率，超声5s，停2s)，用0.5％吐温-20洗3次后再用去离子水洗3次。显微镜观察孢子纯化效果，将纯化后孢子制备成100mg/mL的孢子悬液。

1.6 巨噬细胞培养和吞噬实验

RAW264.7小鼠巨噬细胞置于含10％灭活牛血清的DMEM高糖培养基培养，用含EDTA的胰酶消化后传代。12孔板每孔接种5×10⁵个细胞，培养24h后，每孔加入相同质量的营养态酵母或者酵母孢子，每组设置5个平行，1300r/min离心3min，使酵母落到细胞表面，后续培养30min，PBS洗3次，胰酶消化收集细胞于离心管，4％多聚甲醛同定10min，PBS洗3次。显微镜镜检并统计每100个巨噬细胞吞噬营养态酵母或孢子的个数。

用培养基将母液浓度为10mmol/L的Svk抑制剂白皮杉醇稀释为25μmol/L或50μmol/L的工作浓度；用培养基将母液质量浓度为lmg/mL的P13K抑制剂渥曼青霉素稀释为100ng/mL或200ng/mL。进行抑制实验时，细胞接种于12孔板培养24h，更换为含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培养基并于37℃孵育30min，加入1mg营养态酵母或lmg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，离心并后续培养30min，统计相对吞噬效率。

1.8 无血清吞噬实验

营养态酵母或孢子与巨噬细胞共培养前，更换不含血清的DMEM高糖培养基或含有10％血清的培养基处理2h，随后更换为处理组对应的培养基并分别加入lmg的营养态酵母或酵母孢子，l300r/min离心2min后共培养30min，统计吞噬效率。
1.9高盐以及蛋白酶处理对孢子吞噬效率的影响

野生型酵母孢子经高盐(0.6mol/LNaCl或1mol/LPBS)洗涤后，去离子水洗3次，离心称质量。蛋白酶处理野生型酵母孢子时，取野生型酵母孢子100mg，按照以下反应进行：50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/LCaCl₂，加入200μL蛋白酶K(600U/mL)，于37℃处理1h。之后用0.5％吐温-20洗涤3次，去离子水洗涤3次，超声30s，制备成100mg/mL的孢子悬液。比较处理组与未处理组吞噬效率。

相关链接：腺嘌呤，蛋白胨，蛋白酶K，胎牛血清

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